ABSTRAK
Enzim
adalah suatu protein yang memiliki kemampuan untuk mengkatalisis reaksi-reaksi
biokimia. Dahulu, banyak penelitian menemukan bahwa aktivitas enzim
diasosiasikan dengan protein, namun beberapa ilmuan berargumen bahwa protein
hanyalah bertindak sebagai pembawa enzim dan protein sendiri tidak dapat
melakukan katalisis. Enzim sangat penting dalam kehidupan manusia, karena semua
reaksi metabolisme dalam tubuh dikatalis oleh enzim. Tanpa enzim atau jika
aktivitas enzim terganggu, maka reaksi metabolism sel akan terganggu atau
berlangsung sangat lambat. Percobaan ini
bertujuan untuk dapat melakukan uji aktivitas enzim α-amilase dalam hidrolisis
pati dan dapat menjelaskan faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim.
Dengan menggunakan saliva (air liur) sebagai sumber enzim α-amilase, amilum
sebagai substrat, ekstrak phaseolamin (Phaseolus
vulgaris) sebagai inhibitor, dan larutan iodium sebagai indikator amilum
yang menghasilkan warna biru tua. Alat yang digunakan adalah penangas air
dengan suhu 370C untuk inkubasi, mikropipet, spektrofotometer
sebagai analisis kuantitatif kadar amilum,
serta beberapa tabung reaksi yang diberi label. Faktor-faktor yang
mempengaruhi aktivitas enzim adalah pH, suhu, kadar substrat, kadar enzim,
inhibitor, koenzim dan kofaktor. Aktivitas enzim amylase adalah berperan dalam
memecah karbohidrat menjadi molekul yang lebih sederhana atau yang memecah
polisakarida menjadi disakarida.
A.
PENDAHULUAN
Enzim
adalah protein yang berfungsi sebagai katalisator, senyawa yang meningkatkan
kecepatan reaksi kimia. Enzim katalisator berikatan dengan reaktan, yang
disebut substrat, mengubah reaktan menjadi produk, lalu melepaskan produk.
Walaupun enzim dapat mengalami modifikasi selama urutan ini, pada akhir reaksi
enzim kembali ke bentuk asalnya. Selain meningkatkan kecepatan reaksi, enzim
dapat mengatur kecepatan reaksi dalam jalur metabolik tubuh(1). Amylase
adalah suatu enzim pencernaan yang dalam keadaan normal bekerja ekstrasel untuk
memecah kanji menjadi kelompok-kelompok karbohidrat yang lebih kecil dan
akhirnya menjadi monosakarida. Sumber organ utama amylase adalah kelenjar liur
dan pancreas. Amylase saliva dalam keadaan normal masuk ke mulut oleh sekresi
melalui ductus salivarius(2). Kerja enzim dipengaruhi oleh laju reaksi
enzimatik. Faktor-faktor penting yang mempengaruhi laju reaksi enzimatik adalah
konsentrasi substrat dan enzim, demikian pula faktor-faktor lain seperti pH,
suhu, dan ada tidaknya kofaktar dan ion logam(3). Michaelis-Menten berkesimpulan bahwa kecepatan
reaksi tergantung pada konsentrasi
kompleks enzim-substrat, sebab apabila tergantung pada konsentrasi substrat
akan menghasilkan pertambahan kecepatan reaksi yang apabila digambarkan akan
merupakan garis lurus. Km adalah konstanta Michaelis-Menten, dengan
persamaan(4):
V= (Vmaks [S])/(Km+[S])
Suhu
mempengaruhi aktivitas enzim. Pada suhu rendah enzim menjadi tidak aktif,
karena tidak terjadi benturan antara molekul enzim dengan substrat. Sedangkan
pada suhu tinggi, enzim akan mengalami denaturasi atau struktur enzim akan
rusak(5).
Salah satu inhibitor enzim adalah ekstrak Phaseolus vulgaris .Phaseolus
vulgaris telah diteliti memiliki efek sebagai penghambat enzim saliva dan
pancreas amylase dalam memecah amilum menjadi disakarida dan monosakarida(6).
B.
METODE
Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah gelas
beker, gelas ukur, kaca arloji, kuvet, labu ukur, mikro pipet, mortir dan
stamper, penangas air, pipet tetes, pipet volume, spatula, beberapa tabung
reaksi, dan vortex. Bahan yang digunakan
antara lain: saliva sebagai sumber amylase, larutan amilum , larutan iodium,
buffer fosfat, dan ekstrak phaseolamin. Untuk percobaan awal uji aktivitas
α-amilase dilakukan dengan cara tes iodine pada saliva sebelum dan sesudah
makan crackers gandum. Prinsip pada percobaan ini adalah terbentuknya warna
biru tua antara amilum dengan iodine. Disetiap percobaan, dibaca serapan amilum
dengan menggunakan spektrofotometer. Prinsip spektrofotometer adalah sinar
polikromatis diubah menjadi monokromatis oleh monokromator, dikenakan pada
analit berupa gelombah elektro magnetic diubah menjadi elektrolistrik oleh
detector dan dibaca oleh recorder. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas
α-amilase saliva dengan menggunakan larutan amilum (pati) 0.5%, buffer fosfat
50 mM pH 7.0, larutan iodium, dan air liur (saliva) dari praktikan. Pada cawan
petri, dicampur masing-masing 1 tetes amilum dan saliva, kemudian diamati
perubahan yang terjadi setelah didiamkan 5 menit dan ditambahkan larutan
iodium. Colorless point, disiapkan 11
tabung reaksi yang masing-masing diisi dengan 1 ml buffer fosfat. Pada tabung
1, ditambahkan 1 ml saliva dan dihomogenkan. Dilakukan pengenceran dengan cara
mengambil 1 ml dari tabung 1 kemudian dimasukkan ke tabung 2 dan dihomogenkan.
Begitu seterusnya dilakukan pada tabung-tabung berikutnya. Sehingga diperoleh
seri kadar sampai 1:1024. Tabung 11 digunakan sebagai blanko (berisi buffer
fosfat saja). Ditambahkan pada masing-masing tabung larutan amilum 1%,
dihomogenkan dan diinkubasi 370C. setelah 15 menit, ditambahkan 2
tetes larutan iodium. Uji aktivitas
amylase, disiapkan 7 tabung reaksi. Tabung 1-6 diisi 0.8 ml larutan iodium
(suhu kamar). Tabung 7 diisi 1.5 ml larutan amilum, diinkubasi pada 370C
selama 2 menit, ditambahkan 0.1 ml saliva encer, dicampur dan dicatat waktu
awalnya. Setelah 2 menit, 0.2 ml larutan tabung 7 ditambahkan pada tabung 1.
Pengaruh kadar
enzim terhadap aktivitas enzim.
Saliva 2 ml diencerkan 10X, 20X, 40X, 80X, 160X. Siapkan 6 tabung, satu tabung
untuk blanko (berisi larutan amilum, larutan iodium, dan air suling) dan 5
tabung untuk uji. 5 tabung uji dimasukkan amilum 1 ml, saliva 200 µl dengan
seri kadar yang berbeda, larutan iodium, dan air suling. Setelah dihomogenkan,
dibaca serapannya pada panjang gelombang 580 nm, dan dihitung kecepatan reaksi
enzimatik.
Pengaruh suhu
terhadap aktivitas enzim.
2 ml saliva diencerkan 10X dengan aquades. Disiapkan 12 tabung reaksi yang
bersih. Tabung 1 dan 2 ditempatkan di bejana berisi es 100C. Tabung
3 dan 4 ditempatkan di bejana berisi air , yang suhunya dipertahankan tetap 250C.
Tabung 5 dan 6 ditempatkan di rak tabung, pada suhu ruangan. Tabung 7 dan 8
ditempatkan di penangas air yang suhunya dipertahankan 370C. Tabung
9 dan 10 ditempatkan di penangas air pada suhu 600C. Tabung 11 dan
12 ditempatkan di penangas air mendidih. Tabung ganjil sebagai uji dan tabung
genap sebagai blanko. Seluruh tabung di isi 1 ml larutan amilum, 200 µl air
liur, 1 ml larutan iodium, dan 4 ml aquades. Untuk tabung blanko tidak diisikan
air liur. Kemudian dibaca serapannya pada spektrofotometer.
Pengaruh pH
terhadap aktivitas enzim.
Dibuat dapar dengan pH antara 1 sampai 10 misal 2, 4, 6, 8, 10. Dibuat substrat
amilum dalam berbagai macam dapar dengan konsentrasi 0,4%. Dibuat blanko untuk
masing-masing pH. Masing-masing tabung diisi 1 ml larutan amilum dengan variasi
pH, air liur 200 µl, larutan iodium 1 ml, dan air suling 4 ml. Untuk tabung blanko
tidak diisikan air liur. Kemudian dibaca serapannya pada panjang gelombang 580
nm.
Pengaruh kadar substrat
terhadap aktivitas enzim.Diencerkan
2 ml air liur sebanyak 10X dengan aquades. Dibuat berbagai macam kadar substrat
dengan menggunakan larutan dapar dengan seri kadar 2 %,1.75%,1.5%,1.25%,1%,0.75%,0.5%,0.25%
dan 0%. Disiapkan 1 tabung sebagai blanko. Pada masing-maisng tabung di isi 1
ml larutan amilum, 200 µl air liur, 1 ml larutan iodium, dan 4 ml aquades.
Blanko tidak diberi liur. Dibaca serapannya pada spektrofotometer dengan
panjang gelombang 580 nm.
Pengaruh inhibitor
terhadap aktivitas enzim.
Disiapkan 3 tabung reaksi. Tabung 1 diisi dengan ekstrak phaseolamin
100µl+buffer 300µl+saliva(1:10) 30µl,diinkubasi 370C selama 5 menit,
ditambahkan 100 µl larutan amilum,diinkubasi 370C selama 5 menit.
Tabung 2 diisi dengan ekstrak phaseolamin 100µl+buffer 300µl+saliva (1:10)
30µl+100µl larutan amilum,diinkubasi 370C selama 15 menit,
ditambahkan 100 µl larutan amilum,diinkubasi 370C selama 5 menit.
Tabung 3 diisi buffer 300µl +saliva(1:10) 30µl+100 µl larutan amilum,diinkubasi
370C selama 15 menit. Ditambahkan larutan iodium 1 ml pada
masing-masing tabung dan dibaca serapannya pada spektrofotometer.
C.
HASIL DAN PERHITUNGAN
Percobaan Awal
·
Sebelum
makan crackers gandum: saliva + iodin à berwarna kuning
·
Setelah
makan crackers gandum: saliva + iodin à berwarna biru
1.1 Uji Aktivitas α-amilase Saliva
1.
Reaksi
kuantitatif untuk amylase saliva: Reaksi berwarna biru
2.
Colorless
point: Tabung terakhir yang tidak berwarna adalah tabung nomer 3.
3.
Aktivitas
amylase: Tabung yang berubah menjadi warna merah-bata adalah tabung 7.
1.2 Pengaruh Kadar
Enzim terhadap aktivitas Enzim
Pengenceran Enzim
|
Kadar
|
Au
|
ΔA/menit
|
10X
|
10%
|
0.2241
|
2.3882
|
20X
|
5%
|
0.2148
|
2.3975
|
40X
|
2.5%
|
0.2932
|
2.3191
|
80X
|
1.25%
|
0.6622
|
1.9501
|
160X
|
0.625%
|
2.4509
|
0.1614
|
Absorbansi
blanko (Ab)
|
2.6123
|
||
Pengenceran Enzim
|
Kadar
|
Au
|
∆A/menit
|
10x
|
10%
|
0.2655
|
2.3926
|
20x
|
5%
|
2.4984
|
0.1597
|
40x
|
2.5%
|
2.4662
|
0.1919
|
80x
|
1.25%
|
2.4984
|
0.1597
|
160x
|
0.625%
|
2.5331
|
0.125
|
Absorbansi
blanko (Ab)
|
2.6581
|
||
1.2 Pengaruh Suhu terhadap aktivitas Enzim
suhu
inkubasi
|
Ab
|
Au
|
ΔA /
menit
|
5 sampai 10
|
0.958
|
0.175
|
0.783
|
25
|
0.828
|
0.476
|
0.352
|
suhu kamar
|
0.728
|
0.155
|
0.573
|
37
|
0.762
|
0.631
|
0.131
|
60
|
0.825
|
0.255
|
0.57
|
100
|
1.761
|
2.05
|
-0.289
|
Suhu Inkubasi
|
Ab
|
Au
|
∆A / menit
|
10
|
0,841
|
0,245
|
0,596
|
25
|
0,795
|
0,407
|
0,388
|
Suhu kamar
|
0,850
|
0,271
|
0,579
|
37
|
0,513
|
0,897
|
- 0,381
|
60
|
1,289
|
0,888
|
0,401
|
100
|
2,709
|
2,42
|
0,567
|
1.3 Pengaruh pH terhadap aktivitas
Enzim
pH
|
Ab
|
Au
|
ΔA / menit
|
2
|
0.239
|
0.144
|
0.095
|
4
|
0.188
|
0.107
|
0.081
|
6
|
0.116
|
0.111
|
0.005
|
7
|
0.13
|
0.117
|
0.013
|
8
|
0.634
|
0.114
|
0.520
|
10
|
0.207
|
0.114
|
0.093
|
pH
|
Ab
|
Au
|
∆A / menit
|
2
|
0,149
|
0,237
|
- 0,088
|
4
|
0,143
|
0,142
|
0,001
|
6
|
0,116
|
0,117
|
- 0,001
|
7
|
0,266
|
0,158
|
0,108
|
8
|
0,192
|
0,103
|
0,089
|
10
|
0,168
|
0,133
|
0,035
|
1.4. Pengaruh
inhibitor terhadap Aktivitas Enzim
Tabung ke-
|
Warna
|
Absorbansi
|
K*absorbansi
|
1
|
Merah
|
1,1058
|
5,5292
|
2
|
Merah
|
1,4233
|
7,1167
|
3
|
Merah
|
0,5374
|
2,6868
|
1.5.Pengaruh Kadar Substrat terhadap Aktivitas Enzim
Kadar
|
Au
|
ΔA/menit
|
2%
|
2.959
|
1.041
|
1.75%
|
3.010
|
0.990
|
1.5%
|
2.959
|
1.041
|
1.25%
|
2.913
|
1.087
|
1%
|
2.799
|
1.201
|
0.75%
|
0.908
|
3.092
|
0.5%
|
0.671
|
3.329
|
0.25%
|
0.567
|
3.433
|
0%
|
0.116
|
3.884
|
Absorbansi Blanko (Ab)
|
4.000
|
|
Kadar
|
Au
|
ΔA/menit
|
2%
|
2.7994
|
1.2006
|
1.75%
|
2.7994
|
1.2006
|
1.5%
|
2.7994
|
1.2006
|
1.25%
|
2.7994
|
1.2006
|
1%
|
2.7092
|
1.2908
|
0.75%
|
2.7092
|
1.2908
|
0.5%
|
1.6880
|
2.3120
|
0.25%
|
1.1761
|
2.8239
|
0%
|
0.0905
|
3.9095
|
Absorbansi
Blanko (Au)
|
4.000
|
|
D.
DISKUSI
Pada percobaan awal, sebelum praktikan memakan
crackers gandum saliva setelah ditetesi iodine terjadi perubahan warna menjadi
kuning. Setelah praktikan memakan crackers gandum, saliva setelah ditetesi
iodine terjadi perubahan warna menjadi biru. Hal ini menunjukkan bahwa tubuh
tidak dapat mengkompensasi amilase dalam jumlah yang lebih saat mendapat asupan makanan dari luar. Reaksi kualitatif
untuk amylase saliva, setelah campuran saliva dengan larutan amilum didiamkan 5
menit, terjadi perubahan warna menjadi biru setelah ditetesi larutan iodine.
Perubahan warna biru ini dikarenakan masih terdapat amilum pada saliva sehingga
iodin bereaksi dsengan amilum dan menghasilkan warna biru. Untuk uji colorless
point, tabung terakhir yang tidak berwarna adalah tabung 3. Tabung yang tidak
berwarna memiliki kadar enzim yang tinggi sehingga mampu menghidrolisis amilum
secara sempurna, sedangkan tabung yang lain 4 – 10 kadar amilase sudah tidak
mampu menghidrolisis amilum. Di setiap percobaan, dilakukan analisis kualitatif
menggunakan spektrofotometer. Prinsip alat ini adalah adanya sinar polikromatis
diubah oleh monokromator menjadi monokromatis, diserap oleh analit berupa
gelombang elektromagnetik diubah menjadi elektrolistrik oleh detector dan
dibaca oleh recorder. Pada percobaan ini, digunakan panjang gelombang 580 nm,
yaitu λmaks untuk amilum. Blanko hanya berfungsi sebagai pembanding. Absorbansi
blanko haruslah lebih besar dari absorbansi pada tabung lainnya, karena blanko
tidak berisi amilase. Sehingga dapat ditentukan kecepatan reaksi enzim
(ΔA/menit) dari selisih antara absorbansi blanko dan absorbansi amilum sisa
(Au).
Pada
percobaan uji aktivitas amylase, tabung yang berubah menjadi merah bata / merah
bata pada nomer 7. Pada tabung nomer 7 enzim amilase sudah dapat mendegradasi
amilum secara sempurna sehingga warna biru yang di hasilkan antara reaksi
iodium dan amilum sudah tidak ada lagi. Dan dihasilkan warna merah bata yang
mengidentifikasikan bahwa enzim alfa amilase
sudah mampu menghidrolisis secara sempurna pada tabung nomor 7. Pada
perhitungan aktivitas amilase ( somogyi units/dl) didapatkan hasil 6.428
somogyi units. 1 somogyi units artinya 1mg glukosa yang diproduksi selama 30
menit. Sehingga aktivitas amilase pada praktikum ini adalah 6.428 somogyi unit
yang artinya 6.428 glukosa dalam tubuh yang diproduksi dalam waktu 30menit.
Untuk normalnya dari somogyi units yaiutu 3 somogyi units. Oleh karena itu
dapat disimpulkan bahwa 6.428 somogyi units/dl merupakan hasil yang bagus
karena dengan waktu yang sangat singkat dia mampu menghidrolisis amilum. Kecepatan
reaksi dipengaruhi oleh kadar enzim. Pada hasil percobaan (1.2), tabung 1
dengan kadar enzim 10% memiliki kecepatan reaksi 2.3882. Kecepatan reaksi
paling tinggi adalah pada tabung 2 yaitu 2.3975 dengan kadar enzim 5%. Kemudian
kecepatan reaksi enzim menurun seiiring dengan semakin kecilnya kadar enzim
yaitu pada tabung 3,4, dan 5. Seharusnya ketika enzim semakin diencerkan, maka
absorbansi amilum (Au) semakin besar. Au adalah absorbansi amilum sisa yang
tidak bereaksi dengan enzim. Sehingga kecepatan reaksi semakin kecil. Selain
dipengaruhi oleh kadar enzim, aktivitas enzim juga dipengaruhi oleh suhu. Hal
ini ditunjukkan pada hasil percobaan 1.3. Ketika diberikan suhu yang berbeda
yaitu pada suhu 5-100C, 250C, pada suhu kamar (250C),
pada suhu tubuh (370C), 600C, dan 1000C, maka
aktivitas enzim (ΔA/menit) juga berbeda. Pada data hasil dari 2 kelompok yang
melakukan percobaan ini , suhu optimum enzim adalah 10oC dilihat
dari kecepatan aktivitas enzim yang terbesar yaitu 0.783
dan 0,596. Padahal
dalam literatur atau dari data penelitian terdahulu menunjukkan suhu optimum
enzim bekerja pada suhu 370C-450C. kesalahan hasil
percobaan ini kemungkinan karena human error atau dari bahan yang digunakan
telah mengalami kerusakan.
Kecepatan
reaksi enzimatik juga dipengaruhi oleh keasaman (pH). Pada data hasil percobaan
1.4 oleh 2 kelompok, menunjukkan pH optimal enzim bekerja adalah pada pH 8
dilihat dari selisih absorbansi blanko dengan larutan pada tabung uji yang
paling tinggi, yaitu 0.520 dan 0,089. Pada literature, pH
optimum enzim bekerja adalah 6.5-7. Tabel kedua memiliki kecepatan reaksi
enzimatik (ΔA/menit) bernilai negative. Munculnya nilai negative ini
menunjukkan percobaan mengalami kesalahan, padahal blanko tidak mengandung
enzim yang mengakibatkan berkurangnya kandungan amilum.
Pengaruh kadar substrat terhadap aktivitas enzim. Pada
hasil percobaan yang dilakukan oleh dua kelompok menunjukkan semakin diencerkan
substrat maka semakin kecil kadar substrat yang akan didegradasi oleh enzim, maka
aktivitas enzim meningkat. Seharusnya, semakin kecil kadar substrat akan
menurunkan aktivitas enzim, karena pada kadar enzim yang tetap dengan adanya
penurunan kadar substrat maka hanya sedikit sejumlah enzim yang berikatan
dengan substrat. Pada percobaan ini, perbedaan hasil dengan teori disebabkan
oleh salahnya teknik cara kerja yaitu hanya memakai 1 blanko sebagai pembanding
9 tabung uji yang berbeda kadar substratnya. Pada percobaan pengaruh inhibitor
terhadap aktivitas enzim, dihasilkan dari percobaan bahwa absorbansi
2>1>3. Tidak sesuai dengan literature 1>2>3. Dimana pada literature
apabila enzim dan inhibitor (tabung 1) dicampur dan diinkubasi maka ikatan
enzim dengan inhibitor akan kuat. Kemudian ditambah substrat dan diinkubasi
lagi. Maka seharusnya menghasilkan absorbansi yang lebih besar disbanding
tabung 2. Karena tidak ada persaingan antara inhibitor dan substrat untuk
menempati sisi aktif enzim. Pada tabung 1, aktivitas enzim meningkat dan tidak
berikatan dengan enzim karena sudah terduduki oleh inhibitor. Pada tabung 2:
secara bersamaan mengalami persaingan antara substrat dan inhibitor untuk
menduduki sisi aktif. Pada tabung 3, substrat dengan mudah menduduki posisi
sisi aktif.
E.
KESIMPULAN
1.
Enzim
α-amilase memiliki aktivitas menghidrolisis amilum (polisakarida) menjadi
molekul yang lebih kecil (disakarida).
2.
Aktivitas
enzim dipengaruhi oleh kadar enzim, suhu, keasaman (pH), kadar substrat, dan
inhibitor dilihat dari absorbansi amilum yang tidak bereaksi dengan enzim
dengan menggunakan uji kuantitatif spektrofotometer.
F.
REFERENSI
1.
Marks,
D., Marks, A., Smith, C., Biokimia
Kedokteran Dasar, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta, 96
2.
Ronald,
A., Richard, A., Tinjauan Klinis Hasil
Pemeriksaan Laboratorium, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta, 353
3.
Kuchel,
P., Ralston, G., Biokimia Schaum’s Easy
outlines, Erlangga, Jakarta, 49
4.
Poedjiadi,
A., Supriyanti, T., Dasar-dasar Biokimia,
UI-Press, Jakarta, 140, 150
5.
Robertson,
T., Effect of Temperature Variation on Fungal Amylase Activity, Biology 221 Labssoratory Section, New
York, 2011, 19
6. Vinson, A., Kharrat, H., Shuta,
D., Investigation of an Amylase
Inhibitor on Human Glucose Absorption after Starch Consumption, The Open
Nutraceuticals Journal, 2009, 2, 88-91:88
Tidak ada komentar:
Posting Komentar